不安全因素及解決方法

　　不安全因素 外毒素、熱源、異體蛋白、內(nèi)毒素包括革蘭氏陰性菌、蛋源、血清和環(huán)境。蛋源包括疫苗生產(chǎn)用雞蛋、SPF雞蛋(非致病性沙門氏菌、大腸桿菌等污染)、非免疫雞蛋(魚粉沙門氏菌污染，定期投入抗生素，減少輸卵管炎，蛋殼鈣質(zhì)，畸形蛋)、禽流感疫苗生產(chǎn)用蛋。

　　疫苗污染ET后注射動物的臨床反應(yīng) 腫頭，腫臉，停食停水，局部炎癥，休克，死亡；生產(chǎn)性能降低；免疫功能下降，易發(fā)病，對疫苗應(yīng)答下降。

　　細菌內(nèi)毒素對細胞培養(yǎng)的影響 改變細胞外形；活化細胞產(chǎn)生信息傳遞物質(zhì)，井影響其下游生物；途經(jīng)反應(yīng)；抑制維生素活性；影響細胞附著力。

　　LPS的自發(fā)釋放：內(nèi)毒素主要成分是脂多糖(LPS)；抗菌藥物誘導(dǎo)細菌釋放內(nèi)毒素；抗菌藥物誘導(dǎo)LPS釋放的動物實驗研究；抗菌藥物誘導(dǎo)LPS釋放的臨床研究。

　　應(yīng)用抗生素導(dǎo)致疫苗中內(nèi)毒素的釋放 慶大霉素、環(huán)丙沙星、青霉素、鏈霉素；兔大腸桿菌性腦膜炎―――靜脈注射頭孢噻啶、氯霉素、慶大霉素，在24小時內(nèi)腦脊液中內(nèi)毒素升高2倍~10倍，在臨床上兔的死亡是大量使用抗生素的結(jié)果，因為抗生素殺死了大腸桿菌，大腸桿菌裂解，釋放出大量的內(nèi)毒素，從而將兔殺死。

　　解決方法

　　減少原材料和操作的污染；減少動物源性物質(zhì)的依賴性；改進生產(chǎn)工藝(內(nèi)毒素的消除)：應(yīng)用抗內(nèi)毒素的藥物，如內(nèi)毒素抗體、內(nèi)毒素結(jié)合蛋白(高密度脂蛋白)、多黏菌素B和妥布霉素、類脂A結(jié)構(gòu)類似物(E5531)；抗細胞因子藥物如腺苷類藥物氯氨酮等，糖皮質(zhì)激素類如地塞米松等；抗內(nèi)毒素的中藥，如青蒿素、黃連解毒湯，氨基酸如甘氨酸，乳果糖及膽鹽。

　　內(nèi)毒素的消除―――物理方法 超濾、石棉及活性炭吸附、離子交換層析、親和層析（運用抗內(nèi)毒素抗體)等。

　　動物疫苗的質(zhì)量控制

　　疫苗生產(chǎn)用毒種、生產(chǎn)用細胞(原代細胞、傳代細胞)、疫苗生產(chǎn)工藝、滅活劑、抗生素、血清、佐劑。

　　疫苗生產(chǎn)用毒種 原始種子：我國自行分離和從國外引進。建立3批種子批。主種子批和工作種子批：主種子批是指原始種子批擴增而來；工作種子批是指從主種子批擴增而建立，三級種子均須按《中國獸藥典》要求檢驗。

　　疫苗生產(chǎn)用細胞 原代細胞要求：一般1代~5代內(nèi)，細胞培養(yǎng)用牛血清、胰蛋白酶、培養(yǎng)基等材料應(yīng)符合《中國生物制品主要原材料質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)》要求：疫苗生產(chǎn)的每批細胞均應(yīng)作外源因子檢測，細菌、真菌和支原體檢查，均應(yīng)陰性；傳代細胞的要求：細胞庫的建立：細胞庫體系是指每批產(chǎn)品的起始材料具有一致性；細胞庫通常為二級管理，由主細胞庫和工作細胞庫組成；傳代細胞傳到一定代次后，致瘤性會增強，須進行致瘤性檢查和細胞核型分析；細胞的鑒定：細胞鑒別、外源因子污染、致瘤性、細胞核型或染色體檢測、外源病毒。

　　滅活劑 福爾馬林：其與病毒蛋白的作用初期僅形成羥甲基化合物，其反應(yīng)是可逆的，但一旦形成交鏈后則為不可逆的。福爾馬林作用蛋白的結(jié)果是病毒發(fā)生交聯(lián)作用或是病毒顆粒凝集。同時，這種作用限制了福爾馬林作用于核酸的滅活，因此，在某些情況下盡管病毒抗原已遭到了嚴重破壞，但仍然會有一些病毒存活。

　　β-丙內(nèi)酯優(yōu)點：直接作用于病毒的DNA或RNA，打斷病毒的核酸，使其不能復(fù)制遺傳物質(zhì)而起作用，不破壞病毒的外蛋白：β-PL水解成β-羥丙酸(無毒)；疫苗中無殘留，不影響疫苗的穩(wěn)定性，滅活作用可靠。

　　缺點：β-丙內(nèi)酯與牛血清白蛋白的結(jié)合引起過敏反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)：接種這種疫苗而導(dǎo)致抗牛白蛋白lgE的產(chǎn)生的原因是由于β-丙內(nèi)酯與疫苗中的牛白蛋白結(jié)合，使這種β-丙內(nèi)酯―牛白蛋白的結(jié)合物變形，從而使疫苗接種動物產(chǎn)生抗牛白蛋白lgE，出現(xiàn)過敏反應(yīng)。

　　抗生素 國外最多應(yīng)用的是新霉素，國內(nèi)均用青鏈霉素，慶大霉素和卡那霉素。臨床上新霉素常用于外用，而青霉素、鏈霉素、卡那霉素、慶大霉素常用于肌肉和靜脈注射；抗生素只能用在細胞制備階段。國內(nèi)企業(yè)多個生產(chǎn)步驟均添加抗生素，致使疫苗中抗生素含量較高，是導(dǎo)致疫苗不良反應(yīng)原因之一；疫苗中使用新霉素引起的過敏反應(yīng)的風(fēng)險要小于青霉素、鏈霉素、慶大霉素、卡那霉素。

　　動物血清引起的問題 不需要的細胞、細菌、支原體過量生長；補體、免疫球蛋白、生長抑制因子等有害物質(zhì)成分不明確，影響結(jié)果分析；探測、下游處理和純化；微量遺留蛋白抗原性；中和抗體引起收率降低；突發(fā)污染支原體、病毒和朊病毒；誘導(dǎo)分化；不同批號有區(qū)別；地域、季節(jié)和個體區(qū)別；不確定因素多；價格昂貴等。

　　傳代細胞培養(yǎng)注意的幾個問題

　　前期工作 細胞瓶的新轉(zhuǎn)瓶處理不到位，玻璃中的二氧化硅釋放過多，對細胞有損傷；沖洗轉(zhuǎn)瓶的最后一步應(yīng)用去離子水，而不是注射用水；瓶子刷洗不過關(guān)；洗衣粉或洗滌劑殘留；細胞瓶塞如用再生橡膠塞對細胞有毒性，建議使用硅膠塞；管道系統(tǒng)中細胞瓶塞上的管道使用所謂“不銹鋼”管道對細胞有毒性，建議使用玻璃制成的管道，同時更換硅膠管。

　　營養(yǎng)液成分 水：注射用水應(yīng)通過陰陽離子交換柱處理，經(jīng)電導(dǎo)率儀檢測；基礎(chǔ)培養(yǎng)基來源：進口產(chǎn)品質(zhì)量比較穩(wěn)定可靠，國產(chǎn)產(chǎn)品批次間質(zhì)量不穩(wěn)定；基礎(chǔ)培養(yǎng)基引起細胞凋亡。血清：過濾、鈷60照射除菌。內(nèi)毒素含量都很高，前者常常滅菌不徹底，后者可解決支原體污染，但照射劑量大易破壞生長因子等影響細胞貼壁。從節(jié)約成本角度考慮，建議采用碳酸氫鈉即可滿足生產(chǎn)要求。